抗肿瘤药物活性体内筛选：中空纤维测试法

定义：

中空纤维测试法（Hollow Fiber Assay，HFA）是确定药物细胞毒性的快速体内分析方法，也可以用于分析药物对人体肿瘤细胞系生长的药动学作用，该方法将细胞封装人中空纤维，然后植入小鼠或大鼠的皮下或腹腔。

特点：

目前，有多种不同的体内模型，可用于评估候选抗肿瘤药物的潜在效力，包括皮下植入移植瘤、原位模型以及HFA。HFA经美国国家癌症研究所（NCI）优化，是一种独特的、用于药物发现的体内模型，其可允许在同一实验动物的两个不同生理部位，同时评估抗肿瘤药物对多种肿瘤细胞系的效力。分析使用具有良好生物相容性的半透性纤维，肿瘤细胞装入纤维内。这些肿瘤细胞可以为不同的组织源性，并具有不同的细胞特性。

纤维采用聚偏二氟乙烯（PVDF）材质，纤维截留分子量为500kD。所以，可溶的生物活性物质（如蛋白质，包括肿瘤细胞或宿主产生的生长因子）可通过纤维，而肿瘤细胞不可能与宿主细胞接触。纤维大多数用于植入小鼠，但是也可以将纤维植入大鼠或其它实验动物，以进行抗肿瘤药物的临床前测试。一只小鼠最多可支持6种肿瘤细胞系的生长，所以，可在一只动物体内同时测试多个细胞系。纤维可植入免疫缺陷型或免疫完整的小鼠，因为宿主的免疫细胞不会渗入中空纤维，所以，不会激活肿瘤细胞的免疫反应或妨碍细胞生长。纤维可植入腹腔（i.p.）或皮下（s.c.），所以，有助于评估药物不同给药方式（如静脉（i.v.）、口腔、i.p.和s.c.）的肝通过效果， 从而为后期细胞毒性和抗血管生成化疗等体内测试，提供剂量评估和给药周期的信息。给药处理后，活性细胞增殖和细胞特性，包括细胞循环分布、DNA损伤诱导、细胞死亡诱导（凋亡）、蛋白质表达水平以及细胞形态都可以进行简单地研究。除此之外，也可以分析体内药动学参数，包括药物输送、pH和pO2。

目前，NCI使用12种肿瘤细胞系，作为抗肿瘤药物活性的常规中空纤维筛选。这会用于初步的体内评估，以确定在体外抗肿瘤药物筛选中有可重复活性的药物的潜在体内活性。HFA将药物进行优先化等级划分，优先的药物再进行移植瘤筛选，由于在体外NCI 60种细胞系筛选中，通常会产生大量的活性化合物，使用HFA可减少进入二级移植瘤检测的药物数量。NCI HFA测试一种化合物对12种肿瘤细胞系活性时，需要24只小鼠，而NCI移植瘤模型需要约50只小鼠。在早期临床前药物筛选中使用HFA，符合动物实验替代（replacement）、优化（refinement）以及减少（reduction）的3R原则，控制实验动物的使用量。

自从HFA开发用于药物筛选以来，已有多个研究小组独立证实了药物活性。使用HFA和原代人肿瘤细胞和定性肿瘤细胞系，可证明化学物效力。尽管NCI成功将HFA用于定量确定抗肿瘤活性，这种体内分析方法的角色还可以进一步拓展。HFA已经被用于抗病毒药物的评估，也可以用于其它医学领域。

体内HFA是移植瘤活性的一个良好的预测。药物在移植瘤模型中的抗肿瘤活性，可通过相对肿瘤体积的减小来确定。在HFA中，活性通过活细胞数的降低来确定，可使用MTT分析法进行检测。任何在移植瘤模型中有活性的化合物在HFA通常都具有活性。

移植瘤模型通常不能简单地帮助阐释化合物在肿瘤中的作用机制。由于宿主细胞的“污染”，要从移植瘤模型中回收细胞进行药物学分析，非常复杂。而生长于中空纤维内的细胞可轻松地以单细胞悬浮液的形式进行收获，以进行机制研究，不受宿主细胞的污染。当将HFA用于临床前药动学研究时，化合物可更快地进入临床阶段。另一方面，需要更多关于肿瘤细胞-基质相互作用的信息。使用HFA开发这样一种模型，在其应用中，将是一个新的挑战。

相比标准动物药效模型，HFA具有多种优势。首先，分析可在最短的时间（操作只需2周不到）和使用最少的物料（包括待测化合物和实验动物），获得药物效力的定量指标，不会受到使用移植瘤模型时，大规模动物实验所需的高成本限制；其次，在动物模型中进行研究通常要求大量的时间和资源，以进行测试程序，即使有条件进行，实验化合物也可能只呈现极低的抗肿瘤活性。所以，HFA可防止在移植瘤模型中测试无活性的化合物，从而节省时间和资源。第三，在组织培养中有肿瘤治疗活性的药物，在实体瘤中通常无活性或活性较低，部分原因可能是在这些肿瘤以三维结构生长时，会产生增生和微环境的差异，而中空纤维内的细胞正是以三维结构生长，可更真实地模拟肿瘤生长情况；第四，这种测试方法考虑了药物发挥作用前的药动学行为，以及潜在的生物转化。第五，HFA可有效地用于联合用药的初步体内评估，因为化合物会有一个动态的体内相互作用过程。第六，HFA可防止小鼠遭受肿瘤导致的恶病质。

HFA并不是开发来用替代经典的移植瘤模型。移植的肿瘤细胞在生长时会与宿主组织发生复杂的相互作用，这是不能分析的。细胞不能转移至动物的其它组织，因为纤维阻碍了细胞的迁移。尽管使用纤维时，肿瘤中的血管生成不能被诱导，但是新生血管化可为纤维提供营养，这可能是由纤维内的肿瘤细胞释放的生长因子所诱导的。中空纤维可完美地用作初步工具，以评估化合物达到生长于两个不同生理部位（s.c.或i.p.）的能力，并评估药物是否可在肿瘤细胞内达到药物活性浓度。使用现代的生物荧光技术，已有可能监测纤维内细胞的动态生长情况。

方法

HFA操作程序如图所示：从处于对数期的体外培养中收获所需细胞密度的肿瘤细胞。细胞注入中空纤维，随后纤维两端热密封，防止细胞逸出纤维。密度取决于细胞系，范围可以为1-100x10^5cells/fiber。植入宿主前，将纤维置于组织培养基，37℃、 5% CO2孵育24-48h。植入当天，使用MTT分析确定每种肿瘤细胞系的活细胞量。纤维注入小鼠几天后，开始抗肿瘤给药处理，最长为2周。给药处理后，从宿主取出纤维，进行MTT分析。计算每种细胞系的生长百分比，与赋形剂对照组比较净生长百分比。此外，给药结束时，也可进行其它细胞学分析。

参考文献：

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Bijnsdrop IV, Peters GJ (2017) Hollow Fiber Assay. Encyclopedia of Cancer 1718-1721

体内植入中空纤维膜操作步骤

1. 纤维润洗；2. 细胞注入；3.封端热密封；4. 纤维分段

5. 装入套管针；6. 裸鼠体内植入；7. 皮下及腹腔多个部位植入；8. 创口手术闭合

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