为满足日益严格的监管要求，基因治疗开发商需采用新的工具来保证质量
全球基因治疗市场增长迅速。根据北极星市场研究公司(Polaris Market Research)的数据，该市场在2020年的估值为14.6亿美元，到2028年预计将达到50.2亿美元。这种增长是由基因疗法的潜力所驱动的，基因疗法可以解决日益流行的肿瘤和神经系统疾病，以及罕见的遗传性疾病。根据国家推进转化科学中心的研究，基因治疗与罕见病患者特别相关，因为超过80%的罕见病具有已知的单基因病因。
基因疗法可以用一个有功能的“副本”替换一个缺失或突变的基因，从而永久性地治疗遗传性疾病。然而，要做到这一点，基因治疗需要合适的递送技术，其中最有前途的递送技术是腺相关病毒(AAV)载体。以AAV载体为基础的基因治疗的一个典型例子是诺华公司的Luxturna®，这是美国批准的首个基因治疗产品。
自Luxturna®于2017年被批准用于遗传性形式视力丧失的治疗以来，基因治疗的发展速度越来越快。仅在欧盟(EU)，今年就有望首次批准5项相关产品。此外，数百种基因疗法正在开发中。
为了确保新基因疗法的成功，开发人员和制造商一直致力于提供高质量的产品。公司正在提供新的服务，或者改造现有的服务，以改善遗传特性和质量控制。在这里，记者与多家公司讨论了最新的趋势。
满足监管要求
据BioAnalytix生物开发副总裁JenniferS. Chadwick博士表示，随着新的基因疗法进入市场，监管机构已经提高了获得批准所需的研究“门槛”。她回忆道:“当第一批AAV载体通过监管程序时，出现了很多问题。我们现在看到的是，行业希望用数据来解决这些问题。”
BioAnalytix应用分析方法来促进细胞和基因治疗的开发。例如，该公司可以评估载体蛋白，如图所示，图中描绘了四种常见的基因疗法(左);使用SDS-PAGE可视化其中的复杂性的差异(中间);以及使用液相色谱-质谱法鉴定和量化治疗性蛋白成分，如AAV衣壳蛋白，以及工艺和产品相关的杂质(右)。
基因疗法很昂贵。例如，Luxturna的标价是每只眼睛42.5万美元。随着监管要求的增加，这些高成本使得分析变得至关重要。Chadwick断言:“你需要证明你正在生产正确的产品，它在体内持续存在，而且功效是长期的。否则，你不太可能得到回报。”
Sciex首席执行官和生物制药高级主管Susan Darling表示:“作为分析解决方案提供商，我们看到的趋势是，基因治疗领域的分析存在真正的差距。基因疗法就像多年前的单克隆抗体一样。它们需要更好、更快、更强的分析解决方案来将产品表征转化为制造和质量控制。”
龙沙（Lonza）细胞与基因技术工艺开发全球主管Behnam Baghbaderani博士也提出了类似的观点。“目前一些分析方法中使用的技术还处于早期开发阶段，面临GMP合规性或监管方面的挑战，”他坚持说。“技术发展的步伐可能与增长的步伐不一致。”
衣壳的新功能
基因治疗有效性的一个关键因素是AAV衣壳中是否含有我们的目的基因。空衣壳或部分“填充”衣壳的治疗功效是值得怀疑的，并且/或从安全性和有效性的角度来看，它们可能有不利的影响。Baghbaderani认为，这种不利的影响可能是由于不利的免疫反应或与完整衣壳竞争细胞上的载体结合位点。
检测完整衣壳和空衣壳的主要方法是分析型超速离心法(AUC)和液相色谱法(LC)。Chadwick指出，分析型超速离心法是该应用领域的“金标准”方法。它使用一种带有光学传感器的专用超速离心机来监测溶液中衣壳的大小和密度。
Chadwick补充说:“尽管AUC提供了一个简单的读数，但它可能是一个相当复杂的分析应用。所以，我们也做了很多LC分离工作。液相色谱-质谱法(LC-MS)使用LC仪器分离样品成分，将样品成分送入MS仪器，可以检测衣壳蛋白的质量、结构和数量。”她解释说，“LC-MS在基因治疗分析中越来越受欢迎，因为它为AAV开发者提供了关于病毒衣壳和衣壳蛋白特定属性的高水平细节。这些信息可以提示衣壳在体内的表现。”
用AUC或LC得到的结果可以用透射电镜(TEM)来证实，这是一种直接观察衣壳的技术。它的工作原理类似光学显微镜，但使用电子束来生成图像。TEM的细化进阶是冷冻电镜(cryo-TEM)，样品在低温下进行检测。它在结构生物学中越来越受欢迎，因为它避免了大分子结晶的需要。
Charles River Laboratories为基因治疗开发人员和制造商提供了高分辨率的Cryo-TEM技术。Charles River全球实验室科学科学与战略主管兼公司副总裁Rob Stachlewitz博士说:“Cryo-TEM镜对我们的负染TEM能力有很大的补充。”
“Cryo-TEM，”他断言，“可以让我们在不使用固定剂的情况下，以比其它供应商更高的分辨率，提供衣壳完整性评估和空/部分/完整衣壳的定量。他补充说，“如果将Cyro-TEM技术与基于人工智能的图像分析相结合，就可以测量空/完整/部分衣壳的数量。”
评估病毒载体整合
实时或定量聚合酶链反应(qPCR)技术作为一种检测病毒滴度的方法已得到很好的建立。然而，多项研究表明，液滴数字PCR (ddPCR) 技术可以产生更具可重复性、统计意义显著的结果。ddPCR使用一种水-油乳剂将核酸分成成千上万滴，每滴都像一个微型试管。液滴可以排列在多孔板上。
虽然BioAnalytix专注于蛋白质含量，但Chadwick强调ddPCR是当前基因治疗分析的趋势。“这就是人们现在所期待的，”她说。“它要准确得多。”
根据Bio-Rad实验室的说法，ddPCR比qPCR使用的样本量更小，因为PCR扩增是在每个液滴上进行的。此外，由于表面活性剂的化学作用，样品的细分是在一个单一步骤中发生的。这不仅避免了连续稀释中的移液错误，而且也避免了对复杂微流体的需要。
“最近,我们使用新的ddPCR方法强化了我们的分析能力,因为它们可以提供一些高度可靠的关键的数据…用于评估病毒载体产品的滴度并确定一致性和完整性“Baghbaderani告诉记者，他指出，Lonza正在将基于qPCR的宿主细胞污染物分析转变为ddPCR。
Bio-Rad实验室提供QX ONE液滴数字PCR系统，可作为细胞和基因治疗生产过程中的质量控制工具。例如，它可以建立病毒载体产品的一致性和完整性信息。
另一家采用ddPCR技术的公司是Charles River，该公司将在2021年将该技术推广到所有实验室。该公司打算利用ddPCR在分子生物学方面的能力，因为与传统PCR相比，ddPCR具有“更高的灵敏度和更低的干扰”。
测序的创新
基因治疗的发展可能受益于下一代测序(NGS)的应用。例如，NGS可用于确认靶内效应或检测靶外效应，或检查病毒序列是否已正确整合到细胞系中。许多公司的服务产品都添加了NGS功能。例如，Charles River正将NGS的能力引入其北美工厂。
Cergentis公司提供了一种专利的基因测序技术，称为靶向位点扩增(TLA)。该公司声称，TLA可以测序任何转基因或目标位点，并允许检测整合位点和整合转基因以及周围宿主基因组的序列和结构变异。
Cergentis公司开发的靶向位点扩增(TLA)技术可以对目的基因座或转基因进行靶向富集和测序，也可以检测单核苷酸变异和结构变异。最近一项关于CRISPR工程修饰CAR - T细胞的研究(《自然》杂志2017;543: 113-117)，使用TLA对AAV6 TRAC-1928z整合进行了全基因组图谱分析。
Cergentis的服务主管Judith Bergboer博士表示，TLA可以帮助企业检查病毒载体是否已正确地整合到细胞系中，从而帮助上游生产的质量控制。TLA还可以让公司在细胞系开发的早期阶段检查病毒的基因组成 - 确保没有不需要的结构变异。此外，她说，这项技术可以用来评估异种细胞样本的整合模式和转基因的完整性。
“我们的TLA技术的特点是，它允许你检查[转基因]整合位点和整合序列的完整性，”她强调说。“相当简洁的是，你可以看到关于基因位点的所有有趣的东西。使用TLA，不像很多技术，你只需要知道你感兴趣的位点上非常有限的序列信息。TLA是假设中性的。”
拥抱整合
“人们不想要一个只能做一件事的系统，”Darling说。“他们想要成长、拓展，并随着不断变化的管线而移动。”她断言，Sciex的 PA 800 Plus药物分析系统的一个关键好处是，它可以同时进行三个基因治疗分析，也可以对其他疗法进行分析。“你可以买一个平台来评估转基因AAV的完整性和纯度，”她继续说，“如果你也在开发双特异性抗体，你可以在同一个平台上分析它们。”
PA800 Plus药物分析系统是由Sciex开发的，用于对生物疗法的一系列应用进行表征。例如，在细胞和基因治疗应用中，该系统可以评估衣壳蛋白的纯度，并分析核酸和质粒。
Baghbaderani也提出了类似的观点。他指出，基因治疗开发商迫切希望简化从小规模开发到商业化的过程:“重点是将自动化、高通量分析方法整合到生产过程中，以实现更高效、更快的开发活动。”
他补充说，基因治疗开发商可以从与龙沙等合同开发和制造机构（CDMO）的合作中受益。根据Baghbaderani的说法，龙沙可以在一个平台上提供广泛的分析专业知识 - 从早期的开发到下游的生产。
展望未来
展望未来，Baghbaderani认为基因治疗分析对于开发精简、稳健且符合GMP要求的生产工艺至关重要。Chadwick补充道，使用过程控制分析来确保产品的一致性也很重要。
各家公司也都在寻求提供更广泛的服务。例如，Darling指出，Sciex正在重新利用它在AAV载体上的工作，以满足对设计用于慢病毒的检测的日益增长的需求。该公司还在研究用脂质体代替病毒载体的基因疗法，并在开发RNA分析技术。Cergentis还在开发更广泛的服务。Bergboer指出，该公司正在将其TLA分析服务作为内部使用的工具包。
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