双特异性抗体下游纯化工艺：亲和 & 离子交换层析
本文节选自“Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies”，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“双特异性抗体下游纯化的当前趋势和挑战”。
基于亲和的纯化
Protein A和Protein G亲和纯化：与mAb的情况一样，Protein A亲和层析可以说是bsAb下游工艺中最常用的、基于亲和的纯化方法之一。这种纯化是通过Protein A与目标分子的Fc区域以及对于属于VH3基因家族的目标物的HC的重链可变区的相互作用来实现的。使用Protein A填料的bsAb的一般纯化工艺的细节如前文表1所列，通常在pH7.0-7.4的平衡（EQ）步骤后上样，之后为使用EQ缓冲液进行的漂洗步骤，以及使用醋酸、柠檬酸或甘氨酸缓冲液在低pH＜4.0条件下进行的步骤或梯度洗脱。通过以和Protein A相似的方式识别Fab和Fc抗体区域，但不同的结合特异性，Protein G也被报告可用作纯化抗严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV)/辣根过氧化物酶(HRPO) 产物的捕获步骤，精纯步骤使用以HRPO饱和的m-氨基苯硼酸盐酸盐(APBA)-琼脂糖的特异性亲和方法以消除同型二聚化单特异性抗-SARS-CoV。Protein A和Protein G亲和层析法已被证明可有效去除错配的产物和片段，详细细节将在下文讨论。
去除错配的产物：差异Protein A亲和层析是去除同型二聚HC错配产物的下游工艺方法之一，通常需要在生成bsAb时，对bsAb的其中一个HC进行特定的修饰，以改变Protein A结合亲和性。这是通过bsAb的特殊构建来实现的，其组成的一半来自不能结合至Protein A的大鼠Ab，另一半为对Protein A有高亲和性的小鼠Ab，在Fc和/或VH3区域引入点突变以降低和/或增加对Protein A的亲和性或通过引入一条源自人IgG3的Fc链，后者不结合Protein A。所有这些方法将导致具有与目标bsAb不同的Protein A结合亲和性的同源二聚体产物，从而允许实现有效的分离和杂质去除。与典型Protein A层析方法中使用的步骤洗脱不同，差异Protein A亲和层析法需要一个pH梯度或多步pH洗脱，以区分目标物和不需要的HC错配产物。针对Protein G也开发了类似的概念，其中，引入可破坏Protein G结合的Fc和CH1区域的三个突变的组合，从而实现同源二聚体和异源二聚体之间的差异洗脱。
值得注意的是，Tustian 等使用一系列Protein A填料对一个HC有Fc*序列的目标bsAb的差异Protein A层析进行了详细的研究。虽然Fc*Fc*同源二聚体通常应流穿层析柱，而几乎没有结合作用，而FcFc同源二聚体预计应比目标双特异性Fc*Fc与填料的结合更强。然而，由于来自人VH3基因家族的HC也能够与Protein A结合，VH与重组葡萄球菌Protein A结合可能导致Fc*Fc*被保留，降低了双特异性和FcFc同源二聚体之间的亲和性差异。然而，这可以通过使用基于工程化Protein A的填料(如MabSelect SuRe)来解决，其亲和配基是一个修饰过的非Fab-结合 Protein A结构域。也有报道研究了盐添加物的影响，并观察到促溶盐可提供bsAb和结合FcFc同源二聚体之间出色的分辨率，获得更高的纯度和收率，这可能是由于抗体物质与Protein A配基之间适度的疏水作用。基于该研究，能够实现FcFc同源二聚体和bsAb目标物最佳峰分离的理想填料应该具有较小的颗粒粒径以及具有较大通孔和孔径的基质，以利于液流扩散和传质；其中一个例子是POROS MabCapture A。此外，缺乏VH结合的工程化亲和配基，如MabSelect SuRe，将是允许Fc*Fc*同源二聚体流穿的理想选择。这些特性随后将在MabSelectSuRe pcc Protein A填料中实现，该填料结合了碱稳定的非VH区域结合配基以及具有出色传质性能的基质。
去除片段：除了错配的产物，Protein A层析也被证明可以有效地通过pH梯度洗脱从目标bsAb中分离1/2抗体，其结果可能取决于上样密度。比较从三种填料 - MabSelect PrismA、MabSelect SuRe LX和MabSelect SuRe pcc获得的结果，可以观察到，MabSelect SuRe pcc和MabSelect PrismA都提供了比MabSelect SuRe LX更高的分辨率，而与MabSelect SuRe pcc相比，MabSelect PrismA显示出了更高的载量和碱稳定性。最近报道称，在Protein A层析的洗脱缓冲液中添加500mM NaCl或300mM CaCl2可极大地提高1/2抗体和bsAb之间的分辨率，操作使用从pH5.5（没有盐添加物）到pH ~ 3（用盐添加物）的梯度洗脱。通过使用三个连续的漂洗步骤，该操作被证明可有效去除1/2抗体，而产物收率仅轻微损失，更低的上样密度可获得最高的收率，但1/2抗体去除率下降。
针对特定抗体结构域的Protein A配基结合亲和性和选择性也被证明对从所需的bsAb中分离片段有用。虽然MabSelect SuRe配基极大地消除了与VH3结构域的结合，这可以用于去除某些同源二聚体，如前一节所述，最近的研究表明，MabSelect PrismA配基对VH3结构域的更大亲和力可以增强所需bsAb产物与失去一个Fab臂的产物之间的分离。利用在纤维素纤维基质上含有相同PrismA Protein A配基的Fibro PrismA，可进一步提高分离分辨率，这说明，与基于基球的传统层析介质相比，使用诸如FibroSelect等新兴技术，可以在更快的保留时间内获得更高的分辨率。
固定化金属亲和层析
虽然Protein A亲和层析可能对对称和非对称bsAb很有效，但非源自VH3基因家族且缺乏Fc区域的基于片段的bsAb通常使用其它亲和纯化方法，固定化金属亲和层析(IMAC)是最常用的方法之一，用于含有多组氨酸标签的目标物，因其允许与填料上的固定化金属离子结合。IMAC柱通常以镍、锌、钴离子电荷化，pH 7.2 - 8.0 EQ之后进行样品上样和漂洗步骤，洗脱使用达500mM的咪唑进行。IMAC通常较低的特异性可能导致非特异性蛋白质随目标蛋白共纯化，也可以在漂洗缓冲液中加入低浓度的咪唑，以减少非特异性结合。
CH1/Kappa/Lamda LC 亲和层析：基于片段的bsAb的一种替代性纯化方法，虽然不那么普遍使用，是使用能够与抗体的CH1区域或Kappa (К) 或Lambda（λ）LC结合的亲和配基，从而消除在目标分子中使用聚组氨酸标签的需要。Protein L亲和层析是此类亲和配基的一个例子，它能够与抗体К LC的可变区相互作用，总体纯化过程与Protein A和Protein G亲和层析相似。虽然之前报道的单个Protein L亲和层析步骤的整体纯度较低，为50-70%，通过额外的亲和层析步骤，如Protein A或Protein G层析，可达到所需的更高纯度，我们最近报道在单个Protein L亲和层析步骤后，一步收率为81%，并达到>90%的单体纯度。使用这些亲和配基去除杂质的进一步细节将在下面讨论。
去除错配的产物：KappaSelect亲和填料最近被证明能够将拥有一个КLC恒定区与由两个К LC恒定区组成的物质分开，从而提供了一种方便的方法，可以将错配的同型二聚产物从Fab× scFv bsAb中分离出来。使用相同的bsAb形式，基于CH1的纯化也被证明可以有效地去除由scFv片段组成的同源二聚体。为了克服LC错配，使用连续亲和层析法已被证明对于与两种不同的LC-К和λ共表达的bsAb是有效的，其中CaptureSelect IgG-CH1亲和填料先用来捕获抗体，允许污染物和游离的LC流穿，然后使用Kappa Select亲和填料，去除仅含λ-的抗体；最后是Lambda Fab Select亲和填料，去除仅含К-的抗体。这种顺序亲和层析也通过使用一组骆驼抗独特型单域Ab片段 (VHH) 进行了探索，其特异性地结合到每个臂上正确的HC/LC配对上。通过将各自的VHH偶联到NHS-琼脂糖基球上，有报道称双重抗独特型纯化工艺能够去除错配的HC/LC产物。在另一项研究中，在低pH下，通过控制电导率，如不同NaCl浓度，Protein L层析也被报道可以通过结合价来分离不同的抗体形式。
去除聚体：虽然bsAb聚体已被证明很难使用传统方法有效去除，如Protein A亲和层析，我们和其它一些小组发现，Protein L 亲和层析，结合盐添加物，在去除bsAb聚体方面有极大的潜力。特别是，我们发现，以10mg/mL上样，在洗脱缓冲液中添加Arg·HCl添加物，pH3.0，聚体含量可从细胞培养上清液中的66.5%降低到Protein L亲和层析后的7.1%，回收率为81.3%。有趣的是，我们发现与单体-Protein L相互作用相比，这是通过聚体-Protein L相互作用的优先强化效应来实现的，这与广泛报道的盐添加物在Protein A层析中产生的促溶效应不同。
基于电荷的纯化
基于电荷的纯化通常以离子交换层析的形式作为精纯步骤，在某些情况中作为第一个捕获步骤。在结合/洗脱模式下使用离子交换填料时，通常建议上样pH值与目标分子等电点差1 - 3个单位，在选择合适的缓冲液pH值之前，考虑目标分子的等电点(pI)是很重要的，因为pI在不同bsAb形式中可能存在巨大的差异。例如，含有T细胞受体(TCR)恒定区的工程bsAb，其pI相对较低 (6.1 - -6.5)，这是进一步反映在EQ缓冲液所应用的较宽泛的pH值中，阳离子交换和阴离子交换分别为pH 5.0 - 8.1和pH 7.0 – 9.0。与mAb相比，在洗脱曲线中可以观察到bsAb的多个峰，这通常是通过逐步或梯度方式增加盐浓度达到0.5M NaCl而获得的，这可能不对应于聚体或碎片；相反，它可能是由于多域结构以及在许多bsAb形式中引入灵活铰链的结果，从而导致捕获不同的构象状态。有趣的是，虽然大多数方法采用增加盐浓度来洗脱目标物和分离杂质，但离子交换层析通常需要不同物质之间的pI差异至少为0.5，有研究提出通过使用精确的缓冲溶液来实现高度线性的pH梯度，可能可实现pI差异低至0.1、序列差异仅为一个带电氨基酸的常见LC bsAb的分离。下面将讨论离子交换层析去除错配产物和碎片的方法。
错配产物的去除：有报道称，离子交换层析能够通过引入突变和/或用不同亚类的mAb的某些区域取代某一mAb的特定区域，从而增加它们在pI上的差异，继而从目标bsAb中分离同源二聚体副产物。例如，使用这种方式，非含TCR的同源二聚体副产物可以从经工程设计而含有TCR恒定区的目标bsAb中分离出来，因为后者具有更低的pI(6.1-6.5)。有趣的是，使用强CEX填料，已经证明，接近scFv-IgG bsAb pI的碱性pH(pH8.1)提高了bsAb和双链抗体-IgG错配产物之间的分离分辨率，后者是由于错误形成的二硫键导致的scFv-IgG生成过程中的一个显著(>12%)副产物。SP Sepharose HP和POROS HS50填料都表现出了分离分辨率的增强，这归因于蛋白质净电荷的最小化，因此使得填料能够更好地利用由错误形成的二硫键导致的scFv结构域内细微的构像或电荷差异。
片段的去除：也有报道称，CEX层析可通过在流动相中使用结合聚乙二醇（PEG）的线性pH梯度，而有效去除3/4抗体。以不希望的双链抗体形式存在的片段，据报道在对称性bsAb生成过程中可表达至17%水平，即scFv二聚化时，可变域与其它链的互补域配对，而不是相同链，使用CEX层析 (使用20mM二甘氨酸，pH8.1、10-90mM NaCl以20多个柱体积（CV）进行盐梯度洗脱) 可将其降低到<1%，而使用Protein A层析 (pH梯度洗脱，从pH6.8到pH2.5)则降低到<5%。
原文：S.W.Chen, W.Zhang, Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies. Antibody Therapeutics, 2021 Apr; 4(2): 73–88.
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